基于超微量紫外扫描与生物效应检测鉴别佛手、香圆和枸橼

目的：通过超微量紫外扫描与体外生物效应对佛手、香圆、枸橼进行鉴别。方法：通过光学显微镜观察3种药材的粉末，采用超微量紫外扫描获得佛手、香圆、枸橼提取物的最大吸收波长，通过酶标仪检测药材提取物的DPPH自由基清除、乙酰胆碱酯酶抑制和α - 葡萄糖苷酶抑制活性。结果：佛手、香圆、枸橼粉末的显微特征无明显区别，其紫外最大吸收波长分别为323、285、270 nm，三者均无明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性，但均有显著的α - 葡萄糖苷酶抑制活性，其中DPPH自由基清除活性可用于香圆与枸橼的区分。结论：超微量紫外扫描结合体外生物效应检测是鉴别佛手、香圆、枸橼的有效方法，且3种药材含有潜在的DPPH自由基清除剂与α - 葡萄糖苷酶抑制剂。

中药鉴定发展趋势是简便微量化和生物效应鉴定。简便性是中药鉴定的基本要求，采用更少的试剂符合环境友好的原则，当前基于紫外光谱的微型化鉴定方法发展迅速，该技术利用中药提取物的紫外光谱特征进行快速、无损的鉴定，极大提高了中药鉴定的效率和准确性，降低了中药鉴定的成本。传统的性状、显微、理化鉴定均与药材的生物活性不直接相关。目前，《中华人民共和国药典》和国家药品监督管理局均提出了中药生物效应鉴定指导原则。国内学者也呼吁要增加中药材的生物效应指标。然而，中药的成分复杂、药理作用机制不明确，给生物效应鉴定带来了一定的困难，绝大多数中药缺乏个体化的生物效应鉴定方法。尽管面临着诸多挑战，但发展中药生物效应鉴定仍是必然趋势。佛手、香圆、枸橼均来源于芸香科、柑橘属，三种植物的果实均可药用。其中，香圆、枸橼的干燥成熟果实为药材香橼的来源。佛手、香圆、枸橼功效相似，均可疏肝理气、化痰。传统的性状鉴定可用于佛手的辨识，但不易区分性状特征相似的香圆和枸橼。由于三种药材亲缘关系相近，其显微特征存在相似性。此外，三种药材均含有橙皮苷、柚皮苷等黄酮类成分，传统的理化鉴定难以实现三者的区分。因此，有必要发展新型有效的鉴别方法用于区别佛手、香圆、枸橼。本研究以同科同属的佛手、香圆、枸橼为研究对象，探索超微量紫外扫描与生物效应检测相结合的中药鉴定方法。该鉴定方法符合简便微量化且体现生物效应发展趋势，可为其他亲缘关系相近的中药鉴别提供参考，对于发展新型中药鉴定策略具有积极意义。

仪器与试剂

BIOBASE - EL 10B型酶标仪；

UL - 5000型超微量紫外分光光度计（上海美析仪器有限公司，型号：UL - 5000）；

F - 010S型超声波清洗器（深圳市钰洁清洗设备有限公司，型号：F - 010S）；

力辰 101 型烘箱、力辰 LC -Vortex - P2 型点动混匀仪、FA1004 型电子分析天平（上海力辰仪器科技有限公司，型号：FA1004）。

佛手、香圆、枸橼果实（批号：2021113001，浙江金华、江苏镇江、云南大理）；

1，1 - 二苯基 - 2 - 苦基肼、碘化乙酰硫代胆碱、5，5'- 二硫代双（2-硝基苯甲酸）［批号：C10636623、H1803032、E1922062，阿拉丁试剂（上海）有限公司］；

4 - 硝基苯基 - α - D - 吡喃葡萄糖苷、乙酰胆碱酯酶（批号：J29GS156009、Y23O11Q128361，上海源叶生物科技有限公司）；

α - 葡萄糖苷酶（批号：20200525001，上海鼓臣生物技术有限公司）。

实验方法

样品溶液的制备：分别称取佛手、香圆、枸橼粉末0. 1 g，精密称定，置于离心管中，加甲醇10 mL，超声提取30 min，摇匀，采用针式过滤器过滤，即得。

粉末显微鉴定：取佛手、香圆、枸橼粉末少量，置于载玻片上，滴加饱和水合氯醛2滴，酒精灯加热至透化，滴加稀甘油2滴，加盖玻片置于光学显微镜下观察。

超微量紫外扫描：启动超微量紫外分光光度计，用移液枪吸5 μL水清洗3次，再吸1 μL甲醇作为空白对照。分别吸取1 μL佛手、香圆、枸橼提取物进行检测，确定最大吸收波长。

体外生物活性检测：DPPH自由基清除活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性的步骤以及阳性对照参考本研究组研究成果。

DPPH自由基清除活性：分别取佛手、香橼、枸橼溶液300 μL于不同离心管中作为第1个浓度点，再取300 μL溶液于300 μL甲醇中作为第2个浓度点，依次对半稀释作为梯度浓度。样品孔先滴加50 μL样品，再滴加150 μL DPPH溶液，每个浓度设 4 个复孔。空白孔加入 50 μL 甲醇、150 μL DPPH 溶液，进板分析。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理 。

乙酰胆碱酯酶活性：配制梯度浓度的佛手、香橼、枸橼溶液作为样品。每孔加110 μL PBS溶液（pH值8），再滴加20 μL样品，每个浓度设4个复孔。对照组加入110 μL PBS（pH值8）、20 μL空白溶液。用排枪滴加20 μL的酶液（0. 3 U/mL），孵育5 min后使用排枪50 μL碘化乙酰硫代胆碱与5，5' - 二硫代双（2 - 硝基苯甲酸）的混合溶液，进板分析，在405 nm下读取吸光度，每个样品板共计20 min。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理。

α - 葡萄糖苷酶抑制活性：向样品孔滴加30 μL样品，然后滴加30 μL α - 葡萄糖苷酶溶液（0. 8 U/mL），每个浓度设4个复孔。空白对照加入30 μL溶剂、30 μL酶溶液。孵育30 min后用排枪加入90 μL PNPG溶液，进板分析。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理。

结果

外观鉴定：佛手外观形似手指，成熟果实表面黄色；香圆与枸橼的形状均为类圆形或椭圆形，成熟果实表面黄色，未成熟部分为绿色。

显微鉴定：三种药材的粉末显微特征。佛手、香圆、枸橼的导管均成束且多为螺纹导管，中果皮薄壁组织为不规则的多边形，边缘不均匀增厚。整体而言，佛手、香圆、枸橼的粉末显微特征相似，不易区分。

紫外最大吸收波长鉴定：佛手、香圆、枸橼提取物的超微量紫外波长扫描图。三种药材的最大吸收波长分别为 323、285、270 nm，最大吸收波长具有显著差异。因此，可通过最大吸收波长区分佛手、香圆、枸橼。而且，超微量紫外扫描法操作简单，所需要的样品量为微升级别，符合中药鉴定简便微型化的要求。

体外生物活性鉴定：佛手、香圆、枸橼提取物的 DPPH 自由基清除活性、乙酰胆碱酯酶的抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性。佛手、香圆的自由基清除率超过了50%，其IC 50 值分别为1. 56、1. 93 mg/mL，枸橼的DPPH自由基清除活性低于佛手、香圆。考虑到香圆和枸橼具有相似的性状特征，DPPH自由基清除活性可用于二者的区分。3种药材均无明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性。佛手、香圆、枸橼均有较强的 α - 葡萄糖苷酶抑制活性，其IC 50 值分别为0. 10、0. 12、0. 09 mg/mL，表明3种药材中含有潜在的α - 葡萄糖苷酶抑制剂。

讨论

佛手、香圆、枸橼具有很多共性特征：三者亲缘关系接近，均来源于芸香科柑橘属；三者功效相近，均可疏肝理气、化痰；三者的主要成分均为黄酮类。除了药用，佛手、香圆、枸橼还常用作保健茶，具有较大的市场需求量。在商品规格中，3种药材常切丝用，由于三者在多个方面存在共性特征，这为药材鉴别带来了一定的挑战。针对该问题，本研究采用传统的显微鉴定方法发现，3种药材均具有相似的导管、中果皮薄壁组织，结果显示三者难以区分。基于此种情况，本文提出一种超微量紫外扫描结合体外生物效应检测的整合策略，以实现亲缘关系相近中药的准确鉴别。结果显示，3种药材的提取物在最大吸收波长处具有明显区别。在体外生物活性检测方面，3种药材在自由基清除方面具有差异，可用于区分外观相似的枸橼与香圆。此外，3种药材均具有较强的α - 葡萄糖苷酶抑制活性，表明药材中可能含有抑制α - 葡萄糖苷酶的先导化合物。佛手、香圆、枸橼用作保健茶可能与其潜在的降糖作用有关。

结论

超微量紫外扫描结合体外生物效应检测是鉴别佛手、香圆、枸橼的有效方法。该方法符合当前中药鉴定简便微量化、体现生物效应的发展趋势。3种药材含有潜在的自由基清除剂与α - 葡萄糖苷酶抑制剂，可为后续先导化合物的发现奠定前期基础。

仪器参数

UL-5000超微量紫外可见分光光度计产品参数

1．产品简介

超微量紫外可见分光光度计是一类很重要的分析仪器 ,无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域 ,还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门 ,超微量紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。超微量紫外可见分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。超微量紫外可见分光光度计已成为现代分子生物实验室常规仪器。

2．仪器特点

*检测所需样微量，最低只需0.3ul ,超微量和比色皿双平台

*检测范围宽，比传统的分光光度计的上限高500倍

*对于多数样品而言，无需稀释

*机器无需预热，直接测量，无需检测容器，日常消耗低

*全波长190-1100nm，分辨率1 nm，仪器都自动给出全波长的扫描结果190-900nm

*体积小巧，便携式包装，满足现场检测的需求

*通过PC控制实现更精确和灵活的测量

3．技术指标

*最小样本量：0.3μl

*超微量光程：0.02～1mm连续光程，自动切换

*比色杯光程：10mm/5mm/2mm/1mm

*波长范围：190～900nm

*波长精度：1 nm

*波长分辨率：1 nm

*吸光率精度：±1%（0.76 在 260nm）

*吸光率分辨精度：0.002Abs（1mm 光程）

*吸光率范围：0-750A（等效10mm光程）

*OD600吸光度范围：0～4.000Abs

*OD600吸光度稳定性：[0，3）≤0.5%，[3，4）≤2%

*OD600吸光度重复性：[0，3）≤0.5%，[3，4）≤2%

*核酸检测范围：1.5~37500 ng/μl（dsDNA），检测下限1.5 ng/μl

*蛋白检测范围：0.05~1110 mg/ml（BSA），0.03~540 mg/ml（IgG）

*检测器：紫外增强型cmos线阵传感器

*光源：进口微型氙气闪光灯系统，闪烁10⁹次，寿命长达10年

*测量时间：<3秒

*液晶屏：7寸触摸操作屏，安卓系统

*采用固定光程原理，终身无需校正。可检测易挥发溶剂的样品

*样本检测平台材质：304 不锈钢和石英

关于我们

上海美析仪器公司简介

上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。

美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原子荧光光度计、ICP 电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP 电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有 12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户的同时，美析也与 20 多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。

及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等）