植物过氧化物酶活性测定实验方法的改良

引言

过氧化物酶（Peroxidase，POD）是一种活性较高、广泛存在于植物组织器官中的氧化还原酶，以铁卟啉为辅基，能催化过氧化氢直接氧化酚类或胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用，有效防止过氧化氢在体内的积累，从而对植物体起到保护作用；同时，过氧化物酶能使植物组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,是细胞木质素合成途径中间的关键酶。所以，它与植物体内物质代谢及抗逆性都有着密切关系。因此，过氧化物酶活性测定实验常作为一个重要的生理生化指标进行测定。同时， “过氧化物酶活性的测定”也是植物生理实验教学中的经典性实验，使学生掌握过氧化物酶活性的原理及实验方法，了解过氧化物酶在植物生长发育和抵抗逆境中的作用。在实验中，过氧化物酶活性测定方法有多种，如愈创木酚法、联苯胺法、荧光法等，最常用的方法是愈创木酚法。愈创木酚法虽然具有很多优点，但也有不足之处。在实验教学过程中，我们发现即使是相同的方法，不同的实验指导书所要求的反应时间、温度及磷酸缓冲液pH也有所差异，不同条件下的实验结果与预期结果不尽相同，甚至截然相反；在测定时，一般要求反应时间在3-5 min之间，在代入公式进行计算时，经常由于反应时间的取值范围不准确而得到错误结果，这不仅挫败了学生动手操作的积极性，也降低了实验效率。因此，对愈创木酚法测定植物体内过氧化物酶活性实验条件进行了研究，将其完善，使实验条件更适合学生操作，在规定的时间内达到预期的实验效果。本实验以菠菜、娃娃菜和马铃薯皮为材料，比较了过氧化物酶活性测定的反应时间、缓冲液pH值、温度及稀释倍数对过氧化物酶活性测定的影响，旨在优化植物体内过氧化物酶活性测定条件，为相关实验教学与科研提供参考。

材料

供试材料为菠菜叶片、娃娃菜叶片和马铃薯皮。

试剂与仪器

主要试剂包括

愈创木酚、过氧化氢、磷酸缓冲液、浓磷酸和三氯乙酸，均为国产，分析纯。主要仪器包括

UV-1500型紫外可见分光光度计（上海美析仪器有限公司），

D3024R型高速冷冻离心机，

HSY-24型水浴锅，

MP4002型电子天平

试验方法

愈创木酚法

实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在过氧化物酶催化下，过氧化氢可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚。该物质在470 nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm处的吸光度变化，作出 时间-光吸收值的曲线，求出曲线的斜率，代入相应的公式计算测定过氧化物酶活性。

（1）酶液提取：称取菠菜叶、娃娃菜叶和马铃薯皮各0.5 g，剪碎，分别放入研中，加入2 ml磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH分别为5.5、7.0、7.8）研磨成匀浆（冰浴研磨），再加入8ml磷酸缓冲液，将匀浆液分多次全部转入离心管中，5000 r/min、4 ℃下离心10 min，上清液转入10 ml容量瓶，定容至刻度，低温下保存备用，上清液即为酶的粗提取液。

（2）酶活性测定：酶活性测定分别在温度 25 ℃、30 ℃、37 ℃条件下进行，取5 ml反应混合液（磷酸缓冲液3 mL、0.05 mol /L 愈创木酚1 mL和1 mL 2% 过氧化氢，摇匀），加入1 ml的粗酶提取液（分别稀释2倍、4倍、10倍），立即摇匀，并迅速倒入比色皿中，于470 nm波长下比色，立刻记录吸光度值，以后每30 s记录1次，共计3 min，以缓冲液代替酶液作对照调零。作出A ₄₇₀ 与时间t关系曲线，在曲线前期部分找一段近似直线部分，即反应的初速度阶段。按下式计算酶活性：

式中，∆A ₄₇₀ 为反应初速度阶段内吸光度的变化；

m为植物材料质量（g）；

Δ_t为∆A ₄₇₀ 对应的反应时间（min）；

V _T 为提取酶液总体积（mL）；

V _S 为测定时取用酶液体积（mL）；

0.01为以吸光度值（ΔA ₄₇₀ ）变化0.01为1个酶活性单位（U）

三氯乙酸终止法

步骤如下：酶液提取方法与愈创木酚法相同，而在酶活性测定时，在反应体系中加入酶液后，立即放置于于37 ℃水浴中保温反应15 min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸 2 mL终止反应，适当稀释，470 nm波长下测定吸光度。用加热煮沸5 min的酶液作为对照。

结论

通过本实验研究发现，愈创木酚法测定POD活性的时间取值范围应为0-90 s，缓冲液适宜pH值为5.5、温度为37 ℃，POD活性与稀释倍数之间呈现出近似于线性的关系，稀释倍数增加，酶活性逐渐降低，可根据所测定的A 470 值进行稀释，使所测定的光吸收值处于分光光度计读数0.2-0.8之间，以减少误差。在选取实验材料时，可选用新鲜的娃娃菜和马铃薯皮，取材方便且酶活性较高，稳定性较好，能取得较好的实验结果。菠菜的粗酶提取液的酶活力较低，不合适作为该实验的实验材料。三氯乙酸终止反应法不适用于这三种材料。本实验对植物生理学实验教学及相关科学研究有一定的参考价值。

文章来源：吕春芳,李海霞,贾然然等. 植物过氧化物酶活性测定实验方法的改良 [J]. 轻工科技, 2024, 40 (02): 15-18.

仪器参数

UV-1500PC紫外可见分光光度计

仪器特点

*采用单片微机控制，128*64位液晶显示

*宽大的液晶显示器可显示多组数据

*巨大的内存空间，可存储多组数据和曲线

*自动调0、调100%功能

*波长自动调节

*光源自动切换，滤色片自动切换

*宽大样品池（5mm～100mm）

*具有最多十点标样建标准曲线测量功能

*可通过直接输入K、B因子建立标准曲线进行定量测量

*可直接输入标样和对应浓度值建立标准曲线进行定量测量

*可断电保存测量设置的标准曲线参数

*配备通用并行打印接口，可打印标题栏、测量数据、曲线参数、曲线标准样品点和曲线

*配USB接口

*可通过PC软件控制实现光谱扫描等更精确和灵活的测量要求

技术指标及基本参数

*波长范围： 190～1100nm

*光谱带宽： 2nm

*波长准确度：±0.5nm

*波长重现性：≤0.2nm

*透射比准确度: ±0.3% τ

*透射比重复性：0.15% τ

*杂散光：≤0.05% τ (220nm NaI，340nm NaNO2)

*稳定性： 0.001A/h（500nm预热后）

*测光方式：透过率、吸光度、浓度、能量

*波长调节：自动调节

*光度范围： -0.3～3A

*显示方式： 128*64液晶

*检测器：进口硅光二极管

*光源：进口氘灯，进口钨灯

*电源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz

*功率： 120W

*仪器尺寸：480×350×220mm

*主机净重： 15Kg

关于我们

上海美析仪器公司简介

上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。

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及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等）