Lowry 法测定 B 型肉毒神经毒素蛋白质含量

肉毒毒素是肉毒梭状芽孢杆菌生长、繁殖过程中产生的细菌外毒素，根据抗原性分为 7 个型（A、B、C、D、E、F 和 G 型）。在治疗颈部肌肉痉挛方面，B 型肉毒毒素是一种安全、有效的物质，但常伴随吞咽困难、震颤、血肿、颈部疼痛、无力、恶心、张力过高和注射部位疼痛等不良反应。随着肉毒毒素各类产品的应用日益广泛，当前对肉毒毒素基础研究和提高制品质量研究更显重要。凯氏定氮法被国内外视为法定的标准检验方法，《中国药典》四部（2020 年版）项下凯氏定氮法是通过测定供试品中的氮来计算出蛋白质含量。但供试品中除了含有蛋白质的有机氮也含有无机氮，在测定蛋白质含量的过程中如何减少或排除无机氮的影响成为 B 型肉毒神经毒素蛋白质含量测定的关键技术。凯氏定氮法结果准确可靠，但试验用时长，消耗样品量多，操作步骤烦琐，目前进行蛋白定量并不是首选方法。为寻找适合 B型肉毒神经毒素中蛋白质含量的测定方法，本文通过自建的 Lowry 法与药典方法进行线性关系、精密度试验和重复性试验的比对研究，并使用自建的 Lowry 法对 B 型肉毒神经毒素蛋白质含量进行回收率测定。

材料与方法

样品

试验用 3 批 B 型肉毒神经毒素溶液样品（编号：B-1、B-2、B-3）由兰州生物技术开发有限公司医美研发中心提供。

仪器

紫外分光光度计（UV-1800上海美析仪器有限公司），

酶标仪

试剂

Folin酚试剂（SIGMA公司），

牛血清白蛋白标准品（中国食品药品检定研究院，批号：140619-202125），

碳酸钠、硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾（国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯），

注射用水为公司自制。

溶液的配制

牛血清白蛋白标准品溶液：精密称取牛血清白蛋白标准品 20.0 mg，置于 100 mL 容量瓶中，加注射用水溶解并定容至刻度，摇匀，即得 0.2 mg·mL ^-1 的标准品母液。

标准品线性工作液：精密量取牛血清白蛋白标准品溶液适量，分别置于 10 mL 容量瓶中加注射用水定容至刻度，制成0 mg·mL ^-1 、0.01 mg·mL ^-1 、0.02 mg·mL ^-1 、0.05 mg·mL ^-1 、0.10 mg·mL ^-1 、0.15 mg·mL ^-1 和0.20 mg·mL ^-1的标准品线性工作液。

试验方法

药典方法

按《中国药典》四部（2020 版）通则 0731 项下第二法福林酚法测定 B 型肉毒神经毒素蛋白质含量。

本方法（Lowry 法）

精密移取标准品线性工作液和供试品溶液各50 μL，分别置 96 孔紫外检测板中；各加碱性铜试液 50 μL，室温放置 10 min；各加福林酚试液 [ 取福林酚试液中的贮备液（2 mol·L -1 酸浓度）1-16] 200 μL，振荡摇匀后室温放置 5 min；使用酶标仪在 650 nm 波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白化学对照品溶液浓度对其相应吸光度计算线性回归方程，求得直线回归方程（y=ax+b）。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得蛋白质含量。

统计学方法

运用 SPSS 25.0 统计学软件进行分析，对本方法和药典方法标准曲线进行线性回归分析；对两种方法精密度试验测定值进行配对 t 检验分析（α=0.05），计算 P ＞ 0.05 时两组测定值之间无统计学差异；对两种方法重复性试验测定值进行单组设计 t 检验（α=0.05） [9] ，计算 P ＞ 0.05 时两组测定值之间无统计学差异。

结果与分析

线性关系比较: 药典方法线性浓度范围为 0.04 ～0.20 mg·mL -1 ，以标准品浓度对吸光度进行线性回归y=2.807 5x+0.042 3，R 2 =0.997 2，t=32.883，p ＜ 0.05。由图2知，本方法线性浓度范围为0.01～0.20 mg·mL -1 ，以标准品浓度对吸光度进行线性回归y=1.917 9x+0.051 9，R 2 =0.998 7，t=55.236，p ＜ 0.05；说明两种方法的线性都具有良好的相关性。

精密度试验比较: 使用本方法和药典方法分别对不同浓度牛血清白蛋白标准品（浓度分别为 0.05 mg·mL -1 、0.08 mg·mL -1 、0.16 mg·mL -1 ）进行6次测定，其测定结果见表1。由表1可知，两种方法测定值相对标准偏差为0.48%～1.65%，小于 2%，均符合质控要求，但药典方法的相对标准偏差比本方法大，说明本方法具有更好的精密度。对两种方法的测定值进行配对 t 检验分析：t 0.05 =1.449，P 0.05 =0.207 ＞ 0.05；t 0.08 =2.137，P 0.08 =0.086 ＞ 0.05；t 0.16 =0.662，P 0.16 =0.537 ＞ 0.05，均无显著性差异，说明本方法和药典方法在蛋白质含量测定中具有一致性。

重复性试验: 分别采用本方法和药典方法，测定 3 批 B 型肉毒神经毒素原液中蛋白质含量，做 6 次平行试验，测定结果见表 2。由表 2 可知，两种方法测定值相对标准偏差分别在 0.72% ～ 1.87%，小于 2%，均符合质控要求，且本方法具有更好的重复性。将本方法与药典方法样品测定值进行单组设计的 t 检验：t B-1 =-1.989，P B-1 =0.072 ＞ 0.05；t B-2 =2.058，P B-2 =0.064 ＞ 0.05；t B-3 =-1.413，P B-3 =0.185 ＞ 0.05，均无显著性差异。表明在 B 型肉毒神经毒素蛋白含量测定中，本方法与药典方法测定值具有一致性。

加样回收试验:为进一步确定本方法在实际样品测定的准确度，使用实际样品中加标准品的方式，采用本方法测定 3个不同浓度加标样品中蛋白质含量，每组做 3 个平行试验，测定结果见表 3。由表 3 可知，本方法回收率为97.16%～108.46%，在85%～110%的范围内，符合该测定含量下回收率质控要求。通过加标回收试验可以看出，本方法可以获得较满意的回收率，试验准确度高。

结论

通过对药典方法和本方法的一系列比较及测定，得出以下结论。①两种方法都具有良好的线性关系，但本方法的线性关系优于药典方法，且线性绝对系数优于药典方法。②在测定标准品和实际样品时，两种方法均表现出较好的精密度和重复性。本方法精密度和重复性测定值与药典方法测定值统计学分析均无显著性差异，说明两种方法在理论上均可用于 B 型肉毒神经毒素蛋白质含量测定。③通过回收率试验可以得出，本方法回收率符合该测定含量下回收率质控要求。④本方法在检测过程中大幅度缩短测定周期，提高了检测效率；检测所用供试品少，减少了样品的损失。综上所述，本方法具有快速、省时、方便、需要供试品量少等优点，更适合 B 型肉毒神经毒素中蛋白质含量的测定。

仪器参数

UV-1800PC双光束紫外可见分光光度计

仪器特点

* UV－1800系列采用双光束光学系统，成功实现了高精度和高可靠性测量的完美结合，可满足各种应用的要求，可用在生物研究、生物工业、药物分析、制药、教学研究、环保、食品卫生、临床检验、卫生防疫等领域

* 宽广的波长范围，可满足各个领域对波长范围的要求

* 全自动的设计理念，实现了最简单的测量手段

* 大规模集成电路的设计大大提高了系统的扩展性和可靠性

* 改良优化的光路设计、进口光源和接收器造就了系统高性能和高可靠性

* 丰富的测量方法，具有波长扫描、时间扫描、多波长测定、多阶导数测定（选）、双波长、三波长（选）DNA蛋白质测量（选）等多种测量方法，可满足不同测量的要求，并可在6英寸大屏幕上直接显示

* 根据用户的要求可选配单孔架、手动四连架、手动八连架、自动八连架、玻璃支架、试管架、1cm比色架、5cm比色架、10cm比色架等

* 测量数据可通过打印机输出，具有USB接口

* 可断电保存测量参数和数据，方便用户使用

* 可通过PC软件控制实现光谱扫描等更精确和灵活的测量要求

技术指标及基本参数

* 波长范围：190～1100nm

* 光谱带宽：1.8nm

* 波长准确度：±0.3nm

* 波长重现性：≤0.1nm

* 透射比准确度: ±0.3% τ（0-100%τ）±0.002A(0～0.5A)   ±0.003A(0.5A～1A)

* 透射比重复性：±0.15% τ（0-100%τ）±0.001A(0～0.5A)   ±0.0015A(0.5A～1A)

* 杂散光：≤0.03% τ (220nm NaI，340nm NaNO2)

* 稳定性： 0.0005A/h（500nm预热后）

* 测光方式：透过率、吸光度、浓度、能量

* 波长调节：自动调节

* 光度范围： -4～4A

* 显示方式：六英寸高亮度液晶显示屏

* 检测器：进口硅光二极管

* 光源：进口氘灯，进口钨灯

* 电源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz

* 功率： 120W

* 仪器尺寸：560×450×230mm

* 主机净重： 28Kg

关于我们

上海美析仪器公司简介

上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。

美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原子荧光光度计、ICP 电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP 电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有 12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户的同时，美析也与 20 多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。

及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等）