紫外分光光度法测定木豆叶中芪类化合物的含量

目的：建立木豆叶中芪类化合物的含量测定方法。

方法：采用紫外分光光度法在320ｎｍ处，以白藜芦醇为对照品测定吸收度，并计算其含量。

结果：芪类化合物测定浓度的线性范围为1.300～7.150μｇ／ｍｌ（ｒ２＝0.9960）；平均回收率为101.54％，ＲＳＤ＝0.73％（ｎ＝６）。结论：该法简便，重复性、 稳定性良好，可作为木豆叶中芪类化合物含量测定方法。

木豆叶为豆科植物木豆Ｃａｊａｎｕｓ　ｃａｊａｎ（Ｌ．） Ｍｉｌｌｓｐ．的干燥叶，夏、秋二季采收，除去枝梗及杂质， 晒干。木豆别名观音豆、树豆、三叶豆、野黄豆、山豆根。为世界第六大食用豆类，也是唯一的木本食用 豆类。主要分布于东南亚、印度、缅甸及我国云南、四川、江苏、广东、广西和海南等地。木豆叶脂溶性成分主要含芪类及黄酮类化合物，其中，木豆叶提取物中芪类化合物是一类具有广泛药用价值的药物，具有广泛的药理作用，如抗骨质疏松、降血糖、降血脂、胆固 醇等，其药效和一线用药相当，而且毒副作用小。

现有木豆叶未列入《中国药典》，仅列入《广东省中药材标准》2004年，但标准很低，未有含量测定项。现有木豆叶含量研究有佟美鸿［５］的高效液相色 谱法测定木豆黄酮类物质中牡荆苷、异牡荆苷和荭草苷。郑菲艳等的木豆叶总黄酮含量测定方法。张俊清等的木豆叶中牡荆苷、异美五针松双氢黄酮和木豆芪同时测定的高效液相色谱法。孔羽的首次建立高效液相方法测定木豆叶中木豆素。王惠娟等的木豆叶中木豆多糖测定方法。张俊清等对木豆叶药材质量标准进行了深入研究。上述文献均未见单独测定木豆叶中芪类总量的研究报告。因为木豆叶作为抗骨质疏松的中药材，有明确报道木豆素这类芪类物质发挥主要作用，而本课题是通过建立芪类化合物总量测定方法，对木豆叶提取纯化工艺进行评价。根据报道芪类化合物的分子中都含有1，2－二苯乙烯的基本骨架，318ｎｍ 的吸收是因为其结构上两个苯环通过双键连接起来的长共轭体系的产生，是其特征波长。所以，采用白藜芦醇作为对照品进行，通过测定木豆叶提取物中紫外吸收，建立测定芪类化合物总量方法。

1仪器与药材

紫外分光光度仪（UV1500，上海美析仪器有限公司）；万分之 一天平（瑞士梅特勒天平公司，型号 ＸＰＲ１０）；超声波恒温清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，ＳＢＬ－２２ＤＴ，６００Ｗ，４０ＫＨｚ）白藜芦醇对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：ｗｋｑ１９０２２２０１，纯 度≥９８％）；木豆叶药材（安国市义通中药材有限公 司），木豆叶药材提取物（内蒙古大唐药业股份有限公司自制）；乙醇（天津市北联精细化学开发公司）为分析纯。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备

精密称定白藜芦醇对照品适量，用乙醇溶解，配成12.8μｇ／ｍｌ，摇匀，即得。

2.2供试品溶液的制备

取木豆叶提取物0.10ｇ，精密称定，置25ｍｌ量瓶 中，加适量乙醇溶解，超声（20℃、90％）20ｍｉｎ，用乙醇定容至刻度，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.3检测波长的确定

取2.1和2.2项下对照品和供试品溶液，在200～800ｎｍ波长范围内扫描，结果见图１。

从图１可见，在紫外区内，白藜芦醇的最大吸收波长为320ｎｍ，木豆叶提取物芪类化合物最大吸收波长为318ｎｍ。从图谱上看，木豆叶提取物芪类化合物的波峰没有白藜芦醇的波峰尖，经过对木豆叶提取物芪类化合物波峰附近的吸收度进行对比，在318～320ｎｍ 区间的吸光度差别不大，差别在0.005～0.002之间。综合考虑本试验选定320ｎｍ作为测定波长。  

因此，以白藜芦醇为标准在320ｎｍ 测定木豆叶提取物芪类化合物含量。

2.4线性关系考察

精密吸取2.1项下白藜芦醇对照品溶液1、2、3、4、5、5.5ｍｌ，置10ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320ｎｍ下测定吸光 度。以吸光度值为纵坐标，白藜芦醇浓度（μｇ／ｍｌ）为 横坐标进行回归，绘制标准曲线，计算回归方程。得 ｙ＝0.0946ｘ＋0.0349，ｒ２＝0.9960，见图２，说明白藜 芦醇对照品浓度在1.300～7.150μｇ／ｍｌ范围内与吸 光度线性关系良好。

2.5精密度考察

精密吸取2.1项下白藜芦醇对照品溶液4ｍｌ，置10ｍｌ容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320ｎｍ 下测定吸光度，连续测定6次，记录吸光度值，计算RSD。结果表明对照品溶液 吸光度的RSD为0.06％ （ｎ＝6），说明仪器精密度良好。

2.6重复性考察

取同一批次的木豆叶提取物Ⅱ6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1ｍｌ，置100ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320ｎｍ下测定吸光度，计算样品中 芪类化合物的含量及RSD值。结果表明芪类化合物 含量为96.13ｍｇ／ｇ，RSD值为2.3％，说明本方法重复性良好。

2.7稳定性考察

取木豆叶提取物Ⅱ，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液2ｍｌ，置100ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，分别于0、30、60、90、120、150、180ｍｉｎ在320ｎｍ 波长处 测定吸光度，计算RSD。结果表明供试品吸光度的RSD为1.33％，表明供试品在180ｍｉｎ内较稳定。

2.8加样回收率考察

2.8.1对照品的配制

精密称取白藜芦醇对照品适量，用乙醇溶解配置成13.04μｇ／ｍｌ。

2.8.2供试品的制备

精密称取木豆叶提取物Ⅱ０．１０ｇ，置２５ｍｌ容量瓶 中，加适量乙醇溶解，超声（２０℃、９０％）２０ｍｉｎ，乙醇定 容至刻度，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.8.3加样回收率测定

精密量取2.6项下各供试品溶液0.5ｍｌ，置于100ｍｌ量瓶中，乙醇定容至刻度，摇匀，在320ｎｍ 波长处测定吸光度。 分别取对照品溶液15ｍｌ和各供试品溶液0.5ｍｌ，置于100ｍｌ量瓶中，乙醇定容至刻度，摇匀，在320ｎｍ波长处测定吸光度。计算加样回收率及RSD值，结果见表１。

2.9含量测定

2.9.1提取物中芪类化合物含量测定

共收集到５批次木豆叶提取物样品。按2.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液2ｍｌ （木豆叶提取物 Ⅱ 为精密量取1ｍｌ），置100ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320ｎｍ下测定吸光度，计算样品中芪类化合物的含量，实验结果见表２。

2.9.2木豆叶药材中芪类化合物含量测定

取木豆叶药材１．０ｇ，平行２份，精密称定。分别置具塞锥形瓶中，加２５ｍｌ乙醇溶解，称定重量，超声 （２０℃、９０％）２０ｍｉｎ，用乙醇补足失重，滤过，续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液１ｍｌ，置１００ｍｌ 容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在３２０ｎｍ 下测定吸光度，计算木豆叶药材样品中芪类化合物的含量，实验结果见表３。

3讨论

芪类化合物的分子中都含有１．２－二苯乙烯的 基本骨架，其中２个芳香环上有不同的取代基，常见 的取代基是羟基，据报道羟基周围苯环上的 Ｈ 被异 戊烯基取代将大大增加该类化合物的生理和药理活 性［３］，因此，异戊烯基芪类化合物是近年来研究的热 点。木豆叶具有代表性的芪类化合物木豆素、木豆素 Ａ、木豆素 Ｃ，均为具有异戊烯基的芪类化合物，其中， 木豆叶芪类提取物具有广泛的药理作用，如抗骨质疏 松药理作用等，为本课题的研究重点。 木豆叶提取物为用８０％乙醇提取后，再上 ＡＢ－ ８大孔树脂，用水及不同浓度乙醇洗脱的提取物，如表１，用新建立的方法，可以定量检测出提取纯化效果.

仪器参数

UV-1500PC紫外可见分光光度计

仪器特点

*采用单片微机控制，128*64位液晶显示

*宽大的液晶显示器可显示多组数据

*巨大的内存空间，可存储多组数据和曲线

*自动调0、调100%功能

*波长自动调节

*光源自动切换，滤色片自动切换

*宽大样品池（5mm～100mm）

*具有最多十点标样建标准曲线测量功能

*可通过直接输入K、B因子建立标准曲线进行定量测量

*可直接输入标样和对应浓度值建立标准曲线进行定量测量

*可断电保存测量设置的标准曲线参数

*配备通用并行打印接口，可打印标题栏、测量数据、曲线参数、曲线标准样品点和曲线

*配USB接口

*可通过PC软件控制实现光谱扫描等更精确和灵活的测量要求

技术指标及基本参数

*波长范围： 190～1100nm

*光谱带宽： 2nm

*波长准确度：±0.5nm

*波长重现性：≤0.2nm

*透射比准确度: ±0.3% τ

*透射比重复性：0.15% τ

*杂散光：≤0.05% τ (220nm NaI，340nm NaNO2)

*稳定性： 0.001A/h（500nm预热后）

*测光方式：透过率、吸光度、浓度、能量

*波长调节：自动调节

*光度范围： -0.3～3A

*显示方式： 128*64液晶

*检测器：进口硅光二极管

*光源：进口氘灯，进口钨灯

*电源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz

*功率： 120W

*仪器尺寸：480×350×220mm

*主机净重： 15Kg