分光光度法测定羊毛织物上胶原蛋白的含量

胶原蛋白是一种广泛分布于皮肤、肌腱及骨骼等组织中的结构蛋白，约占总蛋白质含量的1/3，由三条肽链拧成螺旋形纤维状，能有效锁住水分，并具有保湿因子，可以发挥良好的保湿护肤作用。此外，胶原蛋白还表现出极佳的生物相容性和降解性能。胶原蛋白功能性整理技术的研发已成为国内外科研领域的热点。韩国富元公司研发了一种整理工艺，先采用酶对棉织物进行前处理再浸轧胶原蛋白溶液，从而将胶原蛋白牢牢地吸附在织物表面，以赋予棉织物吸湿保湿性，织物的手感更贴近自然。许云辉等采用高碘酸钠先将棉纤维分子链上的羟基局部选择性氧化成醛基，再浸轧胶原蛋白溶液，使胶原蛋白肽链上的氨基与醛基进行化学键合，将胶原蛋白牢固粘结在棉纤维上，制备了亲和、舒适的胶原蛋白涂层棉纤维材料。张燕等深入研究了胶原蛋白改性对亚麻纤维性能的影响，结果显示改性后的亚麻纤维在热稳定性与防紫外线性能上显著提升，折皱回复性有所下降。孔祥曌等采用羊绒与交联剂（戊二醛和异佛尔酮二异氰酸）的架桥作用实现胶原蛋白在其表面的接枝改性，改性后羊绒强度和上染百分率均得到提高，白度基本不受影响。

目前对整理到纺织品上胶原蛋白含量的检测研究很少，仅有韩莹莹、谭玉静等人以9-芴甲基氯甲酸酯为衍生剂，采用柱前衍生-液相色谱法测定的报道，但其操作费时并且价格昂贵，许多实验室并不具备此类精密的仪器。因此，探索如何快速简便地测试整理到羊毛织物上胶原蛋白含量的方法具有一定的意义。羊毛织物与胶原蛋白都属于蛋白质，但它们的氨基酸组成存在差异。胶原蛋白中富含羟脯氨酸这一特殊氨基酸，因此，可以通过定量测定羟脯氨酸来表征胶原蛋白的含量。测定羟脯氨酸含量的方法有比色法、毛细管电泳法、氨基酸自动分析法、气相色谱法[16]和高效液相色谱法等。比色法又称对二甲氨基苯甲醛法或氯胺T显色法，是利用特定化学物质与羟脯氨酸反应生成有色化合物，并通过比色测定该反应产物的吸光度来确定羟脯氨酸含量。

在当前众多羟脯氨酸含量检测方法中，虽然色谱法和氨基酸分析仪法具有准确性、灵敏度和精密度高等优势，但其操作耗时且费用较高。比色法因简便操作和对试验条件要求不高而被广泛采用。基于以上原因，本文以整理到羊毛织物上的胶原蛋白为检测样本，采用比色法测定羟脯氨酸的含量，乘以相应系数转化为胶原蛋白的含量，从而计算出羊毛织物上胶原蛋白的含量。

1.    实验部分

1.1织物、试剂及仪器

织物羊毛织物（无锡协新毛纺织有限公司），羊绒织物（内蒙古鹿王羊绒有限公司）

试剂明胶、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ（包头东宝生物技术股份有限公司），L-羟脯氨酸标准品（L-HYP，纯度≥98%），浓硫酸、无水乙酸钠、氢氧化钠、正丙醇、一水柠檬酸、异丙醇、对二甲氨基苯甲醛、高氯酸、氯胺T（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）

仪器UV-1500PC紫外可见分光光度计（上海美析仪器有限公司），AB104-N型电子天平（瑞士METTLERTO⁃LEDO公司），立式小轧车（佛山市亚力诺精密机械制造有限公司），电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）

1.2实际的配制

1.2.1缓冲溶液（pH=6.4）

取6.5g一水柠檬酸、3.5g氢氧化钠、19.5g无水乙酸钠于250mL烧杯中，用水溶解并转入250mL容量瓶中，加入62.5mL正丙醇，用水定容。

1.2.2氯胺T溶液（C=0.062mol/L）

称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL上述配制的缓冲溶液溶解。

1.2.3显色剂溶液

称取2g对二甲氨基苯甲醛，用7mL60%高氯酸溶液溶解，再缓慢加入13mL异丙醇，现配现用。

1.3试验方法

1.3.1反应机理

胶原蛋白经过3mol/L的硫酸溶液105℃消解后，可分解出羟脯氨酸，羟脯氨酸被氯胺T溶液氧化为吡咯，吡咯与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在559nm处具有最大吸收，反应机理见图1。

1.3.2L-羟脯氨酸浓度-吸光度标准曲线的绘制

L-羟脯氨酸工作液的配制：精确称取50.00mgL-羟脯氨酸标准品，置于100mL容量瓶中，用去离子水溶解，加一滴3mol/L的硫酸溶液用水定容，配制成0.5000g/L的标准储备液。从中准确移取5mL置于500mL容量瓶中，用去离子水将溶液定容。分别量取稀释后的溶液10、20、30、40mL于100mL容量瓶中，用水定容，配制成质量浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的标准工作液。

显色与测试：分别移取4mL不同质量浓度的标准工作液于比色管中，加入2mL氯胺T试剂，室温下放置20min，再加入2mL显色剂。为避免反应过程中受光线干扰，将比色管用锡箔纸包裹，放入60℃水浴中反应20min，取出比色管，用流动水冷却至少3min，室温下静置30min。将氧化显色反应后的标准工作液在500~650nm波长范围内扫描，测定吸收光谱曲线，发现标准工作液在559nm处有最大吸收，因此在559nm处检测不同质量浓度标准工作液的吸光度。

同时做空白样，用去离子水代替标准工作液重复上述步骤测定其吸光度。以扣除空白样的吸光度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。

1.3.3样品的检测

样品的制备：取一定质量的羊毛织物（0.1~4.0g），在常温下将其浸入不同质量浓度的胶原蛋白溶液中（0.1~100g/L），一浸一轧，带液率100%左右。处理后的羊毛织物置于烧瓶中备用。

样品的消解与稀释：量取30mL硫酸溶液（3mol/L）置于上述烧瓶中，在105℃干燥箱中恒温消解16h，接着用圆形滤纸趁热将消解产物过滤至250mL容量瓶中，用10mL浓度为3mol/L的硫酸溶液分三次洗涤烧瓶和滤纸，合并溶液，用水定容摇匀。用移液管移取25mL上述消解液至250mL容量瓶中用水定容摇匀。

显色与测试：与1.3.2节步骤相同。

同时做空白样，以同质量、同颜色的羊毛织物消解液重复上述步骤，测定其吸光度。

1.3.4结果计算

根据样品测定的吸光度，扣除其相应的空白值代入标准曲线方程得到样品中羟脯氨酸的质量浓度，再代入式（1），计算样品中胶原蛋白的含量。

方法来源：[1]赵咪咪,杨瑞婷,王富荣,等.分光光度法测定羊毛织物上胶原蛋白的含量[J].印染,2024,50(07):69-73.

UV-1500PC紫外可见分光光度计

仪器特点

*采用单片微机控制，128*64位液晶显示

*宽大的液晶显示器可显示多组数据

*巨大的内存空间，可存储多组数据和曲线

*自动调0、调100%功能

*波长自动调节

*光源自动切换，滤色片自动切换

*宽大样品池（5mm～100mm）

*具有最多十点标样建标准曲线测量功能

*可通过直接输入K、B因子建立标准曲线进行定量测量

*可直接输入标样和对应浓度值建立标准曲线进行定量测量

*可断电保存测量设置的标准曲线参数

*配备通用并行打印接口，可打印标题栏、测量数据、曲线参数、曲线标准样品点和曲线

*配USB接口

*可通过PC软件控制实现光谱扫描等更精确和灵活的测量要求